KROMATOGRAFI

Oleh : Muhammad Ardiansyah

1.      Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner (diam), dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak).Fase gerak dialirkan menembus atau sepanjang fase stasioner. Fase diam cenderung menahan komponen campuran, sedangkan fasa gerak cenderung menghanyutkannya. Berdasarkan terikatnya suatu komponen pada fasa diam dan perbedaan kelarutannya dalam fasa gerak, komponen-komponen suatu campuran dapat dipisahkan. komponen yang kurang larut dalam fasa gerak atau yang lebih kuat terserap atau terabsorpsi pada fasa diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang terserap akan bergerak lebih cepat. Jadi prinsip dasar pemisahan kimiadengan metode kromatografi adalah kesetimbangan distribusi komponen-komponen senyawa sampel antara ke dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak.

Contoh aplikasinya :

Pemisahan klorofil dari pigmen tumbuhan menggunakan serbuk CaCO3 dalam kolom (fasa diam) dan petroleum eter (fasa gerak). pigmen  fotosintesis yang pertama kali muncul  adalah  pigmen  klorofil  b yang berwarna hijau muda, kemudian pigmen klorofil a yang berwarna hijau tua.

No.	Pigmen	Jarak tempuh pelarut	Jarak tempuh pigmen	Rf
1.	Klorofil a	15 cm	0,8 cm	0,053
2.	Klorofil b	15 cm	11,5 cm	0,767

Klorofil b mempunyai  jarak  tempuh  yang  paling  dekat,dibanding dengan  klorofil a. Jarak yang ditempuh oleh pigmen  klorofil ini tergantung dari  berat molekul klorofil tersebut. Jika berat molekulnya rendah atau ringan, maka pigmen fotosintesis akan terbawa larutan kromatografi lebih jauh. Sebaliknya, jika berat molekul pigmen besar, maka pigmennya pun akan terbawa lebih dekat. Jadi  terbukti  bahwa  klorofil  yang  mempunyai  berat  molekul  yang  lebih  besar  akan menempuh jarak  yang  lebih dekat atau  dengan kata lain pigmen klorofil b  tampak terlebih dahulu.

2.      Yang menyebabkan kromatografi modern sangat mampu memisahkan campuran dibanding metode metode kromatografi biasa (kolom) adalah sebagai berikut :

a.       Kecepatan (speed)

Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang sangat penting dalam hal analsis. Selain itu kromatografi modern memberikan andil dengan maksimal dalam perhatian kepada kondisi lingkungan yang dari hari ke hari jumlah sampel yang mau dianalisis semakin bertambah.

b.      Sensitivitas (sensitivity)

Dengan berkembangnya teknologi mikroprosesor, mulailah orrang menkombinasikannya dengan efisiensi kolom pemisah, mulai skala konvensional (ukuran diameter dalam millimeter) sampai skala mikro yang biasa juga disebut microcolum. Sehingga walaupun hanya dengan jumlah sampel yang sedikit, kandungan senyawa dalam sampel tersebut dapat terdeteksi dengan baik.

c.       Seelektivitas ( selectivity)

Dengan system ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan keinginan, misalnya kation/anion organic saja atau kation/anion anorganik yang ingin dipisahkan. Sehingga kita bias mendapatkan data sesuai dengan apa yang kita analisis.

d.      Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection)

Pendeteksian senyawa-senyawa yang terkandung didalam sampel dapat dianalisis dengan satu kali injek untuk sebuah sampel, sehingga dapat menekan biaya operasional, memperkecil jumlah limbah saat analisis berlangsung, memperpendek waktu analisis serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan.

e.       Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column)

Kebanyakan kolom pemisah bisa bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya konsentrasi sapel yang terlalu tinggi, tidak akan mempengaruhi kestabilan material penyusun kolom.

f.       Efisiensi maksimum (maximum efficiensy)

Kromatografi modern mempunyai efisiensi maksimum karena dilengkapi dengan pengatur temperature dan juga tangki-tangki pelarut yang pengaturannya dikendalikan oleh computer. Dengan demikian untuk memisahkan lima buah senyawa aromatic yang mempunyai struktur mirip dapat dilakukan hanya dalam waktu 60 detik.

3.      Kromatografi fluida superkritik dan profil kromatografi misel cair

a.       Kromatografi fluida superkritik

Kita pada umumnya mengenal dengan baik tiga wujud klasik materi, yaitu padat, cair dan gas. Materi dapat mengalami perubahan keadaan dari satu wujud ke wujud lainnya tergantung suhu dan tekanan yang dialaminya, dan ini biasanya digambarkan dengan suatu diagram yang biasa dikenal sebagai diagram fase. Pada diagram tersebut ada dua titik yang penting untuk diperhatikan, yaitu titik tripel (triple point) dan titik kritik (critical point). Titik tripel adalah suhu dan tekanan di mana fase padat, cair dan gas hadir bersamaan dalam suatu kesetimbangan yang dinamik. Sedangkan titik kritik adalah suhu dan tekanan tertinggi di mana suatu zat masih dapat mempertahankan kesetimbangan antara fase gas  dan cairnya. Di atas titik ini materi berubah wujud menjadi sesuatu yang bukan gas dan bukan pula zat cair. Secara termodinamika materi tersebut sebetulnya dapat didefinisikan sebagai gas, atau lebih tepatnya gas yang dimampatkan, karena terdiri hanya atas satu fase dan memenuhi seluruh bagian ruang penyimpannya. Akan tetapi, sifat-sifatnya yang berbeda dari gas biasa memerlukan penyebutan yang berbeda dan spesifik, sehingga digunakan istilah fluida superkritik (supercritical fluids – SCF) yang dipandang lebih sesuai. Gambar berikut di bawah ini memperlihatkan diagram fase dan tahap perubahan fase karbon dioksida dari cair dan gas menjadi fluida superkritik seiring dengan kenaikan suhu.

Gambar 1. Diagram Fasa CO₂

Gambar 2. Tahap Perubahan fasa Karbon Dioksida

            Tabel berikut di bawah ini memperlihatkan perbandingan sifat-sifat fisika zat cair, gas dan fluida superkritik.  Bisa diamati bahwa fluida superkritik mempunyai gabungan sifat-sifat zat cair dan gas. Berat jenisnya sepadan dengan berat jenis zat cair, sementara viskositasnya setara dengan gas, dan tingkat difusinya berada di antara gas dan zat cair. Dengan sifat-sifat tersebut ia dapat menembus materi padatan lebih cepat daripada pelarut dari zat cair dan mampu dengan cepat pula membawa zat terlarut dari dan ke dalam padatan. Keistimewaan fluida superkritik terutama ada pada sifat dan daya pelarutannya yang dapat diubah dan diatur menurut suhu dan tekanannya. Ini merupakan kunci bagi aplikasinya sebagai media pelarut dan media transpor di banyak proses industri.

Tabel 1. Sifat Fisika Fluida Superkritik dan Titik Kritik Beberapa Senyawa Kimia

Teknologi fluida superkritik sudah sejak lama dimanfaatkan untuk membantu proses industri seperti ekstraksi pada industri makanan dan pemurnian pada industri farmasi, dan juga sebagai teknik analisa, yaitu kromatografi fluida superkritik. Karbon dioksida (CO₂) menjadi pilihan bagi banyak proses dengan teknologi fluida superkritik karena (1) tidak mudah terbakar, (2) tidak beracun, (3) murah, dan (4) titik kritiknya relatif rendah, yaitu 31,3°C dan 72,9 atm (lihat Tabel 1). Air memiliki suhu dan tekanan kritik jauh lebih tinggi, yaitu 374,2°C dan 217,6 atm, sedangkan propana (Tc = 96,8°C dan Pc = 42 atm) dan etana (Tc = 32,4°C dan Pc = 48,2 atm) jelas mempunyai tekanan kritik lebih rendah tapi mudah terbakar. Keuntungannya yang lain adalah ketersediaannya yang melimpah dari alam dan dari hasil produk-samping berbagai proses industri serta mudah pula didaur-ulang. Ini semua boleh dibilang memenuhi kriteria kimia hijau (green chemistry) yang mensyaratkan "carrying out chemical activities – including chemical design, manufacture, use, and disposal – such that hazardous substances will not be used and generated", yaitu agar segala kegiatan yang melibatkan zat-zat kimia – termasuk perancangan, pembuatan, pemakaian, maupun pembuangannya –dikerjakan sedemikian rupa hingga tidak memerlukan pemakaian ataupun menghasilkan zat-zat berbahaya.

b.      Profil kromatografi misel cair

Kromatografi cair misel (MLC) adalah mode fase-terbalik kromatografi cair (RPLC) dengan larutan surfaktan, yang mengandung gugus fungsi ionik maupun non-ionik pada konsentrasi yang melebihi konsentrasi misel kritis (cmc), sebagai fase gerak. Dan misel ditambahkan pada monomer surfaktan sebagai fase gerak. sedangkan fase diam dilapisi dengan monomer adsorpsi surfaktan, membentuk permukaan mirip dengan bagian luar misel. Keberadaan misel dalam fase gerak dan modifikasi permukaan fase diam mempengaruhi retensi, selektivitas dan efisiensi. zat terlarut non-polar dielusi fase gerak dengan baik zat terlarut non-ionik atau ionik surfaktan dan terionisasi dielusi dengan fase gerak surfaktan non-ionik hanya akan menyukai non-polar, dipol-dipol dan donor-akseptor proton interaksi dengan misel dan fase diam. terionisasi zat terlarut juga akan berinteraksi elektrostatis dengan lapisan luar dari misel ion dan lapisan surfaktan dikenakan pada fase diam. Dalam hal apapun, faktor sterik juga penting. Zat terlarut dipisahkan berdasarkan partisi perbedaan antara fasa air diam dan misel dalam fase gerak, dan antara fasa air gerak dan fase diam.

Gambar 3. Berbagai karakteristik misel

MLC memanfaatkan perangkat keras yang sama (pompa, injector, tubing, detektor, dll) sebagai RPLC klasik dengan campuran pelarut-air organik. Karakteristik paling menarik yang ditawarkan oleh MLC sehubungan dengan RPLC klasik adalah fleksibilitas yang besar yang dihasilkan oleh berbagai jenis zat terlarut-misel dan interaksi solut-dimodifikasi fase diam, perubahan selektivitas, overlaping tailing untuk obat dasar dikromatografi dengan kolom konvensional , analisis sampel yang mengandung senyawa dalam berbagai polaritas menggunakan elusi isokratik, dan injeksi langsung cairan fisiologis, menghindari pengotor pra-pengobatan yang diperlukan dalam RPLC klasik.

Meskipun murni fase gerak misel kadang-kadang digunakan, pemisahan yang paling dalam MLC dilakukan dengan hibrida fase gerak misel dalam media buffer, yaitu larutan misel yang mengandung sejumlah kecil dari suatu pelarut organik, terutama alkohol rantai pendek, dengan propanol menjadi paling umum. Stabilitas yang tepat dari fase gerak misel sangat penting. Sebuah surfaktan yang cocok untuk MLC harus memiliki cmc rendah. Sebuah cmc tinggi akan berarti beroperasi pada konsentrasi surfaktan yang tinggi, yang akan menghasilkan solusi kental, memberikan tekanan sistem yang tidak diinginkan tinggi dan kebisingan latar belakang detektor UV. Pemilihan sering terbatas pada surfaktan berikut ini: anionik sodium dodecyl sulfat (SDS), yang bromida cetyltrimethylammonium kationik (CTAB) dan non ionik Brij-35.

Pemilihan pengubah pelarut organik yang sesuai di MLC harus mempertimbangkan polaritas dari analit. Untuk senyawa polar, waktu retensi cukup pendek (di bawah 20 menit) diperoleh dengan 1-propanol, 2-propanol atau asetonitril. Untuk senyawa non-polar atau senyawa dengan afinitas tinggi untuk surfaktan teradsorpsi pada fase diam, pelarut kuat sebagai 1-butanol atau 1-pentanol yang needed. Namun, perlu dicatat bahwa kedua alkohol terakhir menimbulkan pembentukan konsentrasi mikroemulsi di cukup tinggi.

Salah satu fitur yang paling menarik dari MLC adalah kemungkinan injeksi langsung cairan fisiologis (misalnya, urine, plasma, serum dan susu) tanpa perawatan pra lain-selain filtrasi, dengan tidak ada peningkatan tekanan sistem atau tidak ada kerusakan terlihat setelah serial berulang injection protein, mempercepat gerak kolom yang tersapu tanpa bahaya. Hal ini dapat mempengaruhi deteksi senyawa sisa rendah. Namun, perlu dicatat bahwa SDS adalah surfaktan hanya biasa digunakan dalam MLC yang efisien solubilizes protein dalam matriks fisiologis. Juga, adalah praktik yang baik untuk mencegah kontaminasi kolom mungkin dengan cara pengenceran atau penyaringan sampel sebelum injeksi. Beberapa contoh, seperti serum, perlu sentrifugasi sebelum analisis kromatografi. Ini sedikit pra-perawatan meminimalkan paparan kolom untuk senyawa yang tidak diinginkan.

 

4.      Kromatogafi Gas dan kromatografi Cair

A.    Kromatografi Gas

Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya dalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fasa gas bergerak dan fasa diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya. Sedangkan dalam kromatografi padat-gas, digunakan suatu zat padat penyerap. Ide untuk memfraksionasikan gas-gas dengan menginteraksikannya terhadap suatu zat padat atau cairan tidak bergerak memalui suatu aksi selektif terhadap suatu komponen tertentu, pertama kali disarankan pada tahun 1941. Metode ini menjadi populer setelah tahun 1955. Pemakaian zat cair sebagai fasa diam ternyata lebih meluas dibandingkan zat padat, sehingga teknik ini kadangkala dikenal sebagai kromatografi gas-cair.

Prinsip Kerja Kromatografi Gas

Senyawa gas yang sedang dianalisis berinteraksi dengan dinding kolom yang dilapisi dengan berbagai tahapan fasa diam. Ini menyebabkan setiap kompleks elute diwaktu yang berbeda, yang dikenal sebagai ingatan waktu yang kompleks. Perbandingan dari ingatan kali yang memberikan kegunaan analisis kromatografi gasnya. Kromatografi gas yang pada prinsipnya sama dengan kromatografi kolom (serta yang lainnya untuk kromatografi, seperti HPLC, TLC), tetapi memiliki beberapa perbedaan penting. Pertama, proses memisahkan senyawa alam campuran dilakukan antara fasa cair diam dan fasa gas gerak, sedangkan pada kromatografi kolom yang seimbang adalah tahap yang solid dan bergerak adalah fasa cair. Kedua, melalui kolom yang lolos tahap gas terletak disebuah ovendimana temperatur gas yang dapat dikontrol, sedangkan kromatografi kolom (biasanya) tidak memiliki kontrol seperti suhu. Ketiga, konsentrasi majemuk dalam fasa gas adalah hanya salah satu fungsi dari tekanan uap dari gas.

Cara Kerja Kromatografi Gas

Sampel diinjeksikan melalui suatu sampel injection port yang temperaturnya dapat diatur, senyawa-senyawa dalam sampel akan menguap dan akan dibawa oleh gas pengemban menuju kolom. Zat terlarut akan taradsorpsi pada bagian atas kolom oleh fasa diam, kemudian akan merambat dengan laju rambatan masing-masing keomp[onen yang sesuai dengan nilai Kd masing-masing komponen tersebut. Komponen-kompomnen tersebut terelusi sesuai dengan urut-urutan makin membesarnya nilai koefisien partisi (Kd) menuju ke detektor. Detektor mencatat sederetansinyal yang timbul akibat perubahan konsentrasi dan perbedaan laju elusi. Pada alat pencatat sinyal ini akan tampak sebagai kurva antara waktu terhadap komposisi aliran gas pembawa.

Skema Alat Kromatografi Gas

B. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

Kromatografi HPLC adalah salah satu pengembangan kromatografi cair. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fasa diam yang terikat secara kimia pda penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit (kolom) dan fasa gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang tekendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waqktu yang relativ singkat. Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solut melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya, dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak depat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalm HPLC merupakan salah satu factor penentu keberhasilan dalam proses pemisahan. Kolom  utama berisis fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung keperluan. Fasa diam jenis terikat dapat dengan mereaksikan silika denan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi silanisasi.

Prinsip Kerja Kromatografi HPLC

Dalam metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam-macam diameter. Pertikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagaipenunjang statsioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fasa bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memerlukan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel menunjukan satasioner tidak selalu menguntungkan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter sekitar 2-8 mm dengan ukkuran panjang partikel 50 mm, sedangkan laju alilran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi.
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yanng biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fas geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi). Misalnya air: asetonitril (80:20). Hal ini bergantung pada kepolaran anallit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatan untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Cara Kerja HPLC

Adapun cara kerja dalam metode HPLC ini adalah sebagai berikut :
a. Instrumen diperiksa, terutama jika tidak dipakai terus-menerus

Ini dilakukan untuk menecek apakah telah dipasanga kolom yang tepat, apakah spektrum injektor tidak rusak (apakah ada lubang besar atau bocor karena sering dipakai), apakah sambungan saluran gas kadap, apakah tutp tanur tertutup, apakah semua bagian listrik bekarja dengan baik, dan apakah detaktor yang terpasang sesuai.

b. Aliran gas ke kolom dimulai atau disesuaikan

Ini dilakukan dengan membuka katup uatama pada tangki gas dan kemudian memutar katup (diafragma) sekunder sekitar 15 psi dan membuka katup jarum sedikit. Ini memungkinkan aliran gas yang lambat (2-5 ml)/menit untuk kolom kemas dan sekitar 0,5ml/menit untuk kolo, kapiler melewati sistem dan melindungi kolom dan detektor terehadap perusakan secara oksidasi. Dalam banyak instrumen modern, aliran gas dapat diukur dengan rotameter atau aliran otomatis atau pengendali tekanan, atau dapt dimasukkna melalui modul pengendali berlandas mikroprosesor. Apapun jenisnya, sambungan sistem (terutama sambungan kolom) harus dicek denga larutan sabun untuk mengetahui apakah ada yang bocor, atau dengan larutan khusus untuk mendeteksi kebocoran (SNOOP), atau dapat juga dengan larutan pendeteksi kebocoran niaga.

c.       Kolom dipanaskan sampai suhu awal yang dikehendaki

Ini dilakukan, pada instrumen, buatan lama dengan memutar transformator tegangan perubah yang mengendalikan gelungan pemanas dalam tanur sekitar 90 V.

Skema Alat HPLC